Formación de biofilms en membranas de separación de lácteos

Nuria García

Introducción

El uso de procesos de separación por membrana permite la concentración y el fraccionamiento de los componentes del suero para obtener valiosos ingredientes para alimentos y otras aplicaciones. Es por esto que los fabricantes emplean diferentes técnicas de separación con membranas que incluyen ultrafiltración (UF), microfiltración (MF), nanofiltración (NF) y ósmosis inversa (OI), para separar los componentes del suero y crear productos según las especificaciones exactas del usuario final¹⁶.

Los diferentes productos obtenidos del suero como el suero en polvo, el concentrado de proteína, el aislado de proteína, las fracciones de proteína, el hidrolizado de proteína, el suero con contenido de lactosa reducido y el suero desmineralizado o con contenido reducido en minerales, se logran variando los niveles de proteína, minerales y lactosa, así como diversas propiedades funcionales²⁰. El valor del producto aumenta al aumentar la concentración de proteínas. La principal diferencia entre las membranas de MF, UF, NF y OI es su selectividad.

El factor de retención es una medida de la capacidad de la membrana para separar componentes de la solución de alimentación, ya que refleja la selectividad de la membrana²⁵.

El tamaño de los poros (determinado por la estructura del material de la membrana) definirá qué moléculas se retienen y qué moléculas fluyen a través de ella. Asimismo a medida que el límite molecular se reduce, la presión operativa necesaria es mayor.

Las membranas se pueden fabricar con materiales cerámicos o poliméricos semipermeables. En las membranas tubulares de cerámica inorgánica el tamaño de los poros es muy uniforme, además tienen una buena selectividad y son muy resistentes a la temperatura y a los productos químicos²⁵. De esta forma, son fáciles de limpiar y su vida útil es de más de 10 años, sin embargo, son de 3 a 10 veces más caras que las membranas poliméricas orgánicas enrolladas en espiral, pues se comercializan en un rango limitado de tamaños de poros y normalmente solo se usan para MF y, en algunos casos, procesos de UF¹⁰.

Las membranas poliméricas enrolladas en espiral constan de varias capas de materiales de membrana enrolladas alrededor de un tubo de permeado, siendo uno de los materiales más comunes debido a su área de superficie más grande, espacio limitado, alta densidad de empaquetado, altos flujos de permeado y menor coste de reemplazo. Algunas de sus desventajas son una vida útil limitada, susceptibles de ensuciamiento y limpieza difícil, pues requieren un pretratamiento extenso y resultan menos adecuadas para soluciones de alimentación viscosas, tolerancias limitadas de pH y temperatura para la limpieza y el funcionamiento²⁵.

El problema del ensuciamiento

En unas condiciones ideales de separación, se permitiría el flujo continuo del líquido a la presión aplicada. Sin embargo, el rendimiento de la membrana se ve comprometido por el ensuciamiento o la acumulación de macromoléculas adsorbidas, geles y partículas depositadas sobre o en la superficie de la membrana, lo que causa polarización de la concentración y afecta a su selectividad. Para controlar el ensuciamiento y reducir el problema del bloqueo de los poros, la filtración se realiza a mayores velocidades de flujo cruzado y baja presión transmembrana²⁴.

Por lo tanto, el ensuciamiento es un problema crítico en la tecnología de filtración por membranas, especialmente en membranas poliméricas que son relativamente hidrófobas y facilitan la adhesión de proteínas en comparación con las membranas cerámicas². El ensuciamiento en general tiene un efecto significativamente perjudicial sobre la eficiencia de los procesos de separación, lo que provoca una disminución del flujo, una caída de la presión, un aumento de la energía de bombeo requerida (y del coste asociado), una vida útil más corta de la membrana, y de esta manera una composición y calidad del producto inconsistentes.

El suero es el subproducto líquido obtenido tras los procesos de elaboración de queso y caseína y está compuesto principalmente por agua (93/100g), lactosa y proteínas. Con frecuencia se usa la OI en las concentración de suero para reducir los volúmenes y aumentar el contenido de sólidos antes del transporte o procesamiento posterior. La OI es una técnica de separación mediante la aplicación de presión en la que se emplea una membrana que tiene tamaños de poro de menos de 0.001 micras para separar los diferentes componentes de una mezcla líquida.

La bioincrustación, incrustación biológica, o acumulación de partículas en suspensión, es uno de los problemas críticos de la tecnología de filtración por membranas²², ya que tiene un efecto significativamente perjudicial en la eficiencia de los procesos de separación, lo que causa una disminución del flujo, una caída de presión, una vida útil más corta de la membrana y una composición y calidad inconsistentes del producto. Los biofilms juegan un papel importante en la bioincrustación, pero en la industria lechera, el principal motivo de preocupación es la proliferación de bacterias patógenas en los biofilms, que contribuyen a la contaminación del producto con bacterias potencialmente patógenas representando una posible amenaza para la salud pública.

La composición y textura de la superficie de la membrana tendrá un impacto en la adhesión inicial de las bacterias. Los factores que pueden afectar al desarrollo de biofilms son la fuente de carbono, temperatura, producción de exopolisacáridos, limpieza y desinfección ineficaces y la hidrodinámica del sistema de distribución de fluidos⁸.

El problema de los biofilms en las membranas de filtración

A través de la naturaleza, las bacterias prosperan predominantemente en comunidades multicelulares o biofilms adheridas a superficies e incrustadas en una matriz autoproducida de sustancias poliméricas extracelulares²⁸ (SPE). Esta es una elección de estilo de vida no trivial y tiene grandes consecuencias para la fisiología celular y la supervivencia²⁴. En muchas industrias, los biofilms son perjudiciales y causan corrosión, obstrucciones de tuberías, fallos en los equipos, apariencia, olores desagradables y deterioro del producto e infecciones, generando altos costes de limpieza y mantenimiento⁹.

De esta manera los biofilms desempeñan un papel importante en la bioincrustación de la membrana y contribuyen a la contaminación del producto con bacterias potencialmente patógenas que podrían amenazar a la salud pública. Para restaurar el flujo, los procesos de separación con membrana deben detenerse después de haber estado funcionando continuamente durante al menos 20 horas y aplicar la limpieza CIP (cleaning in place).

Bajo este orden de ideas, los biofilms son bien conocidos por su resistencia a los agentes de limpieza y biocidas. Dentro de estos, las células bacterianas que se encuentran en las capas más profundas están protegidas de las sustancias tóxicas y tienen un mejor acceso a los nutrientes. La amplia distribución y la importancia de los biofilms ha hecho que se dediquen considerables esfuerzos a desarrollar materiales que eviten la adhesión bacteriana, además de nuevos agentes de limpieza o estrategias para eliminar los biofilms persistentes.

El conocimiento de la estructura de los biofilms y su formación se ha ampliado notablemente en la última década, pero incluso a pesar de todos los mecanismos moleculares, genéticos y modelos matemáticos que se han estudiado en detalle³, muchas industrias luchan por erradicar este problema. En los sistemas de filtración de la industria lechera quedaban por abordar algunas cuestiones:

• si el uso de cultivos de iniciación que producen exopolisacáridos,  durante la elaboración del queso mejoraría la formación de biofilms en las membranas de procesamiento del suero, gracias a la presencia de estos polímeros que actuarían como un “pegamento”.
• si las SPE producidas por los organismos que normalmente viven en esas membranas tendrían un efecto sobre la unión inicial de las células a la membrana o, más bien, apoyarían la cohesión célula-célula o ambas situaciones.
• si podría existir una estrategia para reducir la formación de biofilms en las membranas de filtración de productos lecheros dirigidas a las SPE bacterianas que mantienen unidas las células.

La estructura de un biofilm no es uniforme en el tiempo ni en el espacio²⁸. Es importante estudiar las interacciones entre las bacterias y las superficies, en un entorno específico de procesamiento de alimentos para proporcionar medidas más efectivas para prevenir la formación de biofilms y para su eliminación²⁹. Comprender el mecanismo de unión bacteriana es fundamental en el desarrollo de tecnologías anti-bioincrustación para sistemas de membranas.

Mecanismos de adhesión bacteriana

La conditioning layer es la base sobre la que crece un biofilm. La unión de una célula a un sustrato se denomina adhesión y la unión de célula a célula se denomina cohesión. Los mecanismos detrás de estas formas de unión, en última instancia, determinan las propiedades adhesivas y cohesivas que mostrará un biofilm⁹. La adhesión hace referencia al estado en el que dos cuerpos diferentes se mantienen juntos mediante un contacto interfacial íntimo, de modo que la fuerza mecánica o el trabajo se pueden transferir a través de la interfaz³⁰. Las fuerzas que mantienen unidas las dos fases pueden ser fuerzas de van der Waals, enlaces químicos o atracción electrostática.

Los biofilms se crean cuando las células bacterianas se adhieren a una superficie y se desarrollan siguiendo diferentes etapas de maduración a medida que crecen las bacterias²³. La primera fase de la adhesión bacteriana implica interacciones fisicoquímicas, dando lugar interacciones moleculares y celulares²⁶. Múltiples factores influyen en la adhesión de las células a un sustrato, incluidos factores ambientales como la disponibilidad de nutrientes, las condiciones del flujo o las características de la superficie de los microorganismos y del sustrato²¹.

Características de la superficie de la célula/sustrato

En la unión inicial de las células bacterianas a las superficies se producen ciertas interacciones fisicoquímicas entre las mismas y el sustrato que se describen por la teoría extendida de Derjaguin, Landau, Verwey y Overbeek²⁷. Tales fuerzas incluyen las interacciones de Lifshitz-van der Waal, ácido/base y electrostáticas.

Se ha observado que las células hidrófobas se adhieren en mayor medida que las células hidrófilas a discos de poliestireno en un agitador rotatorio²⁷. Primero, se observó que la extensión de la colonización microbiana parece aumentar a medida que aumenta la rugosidad de la superficie, porque en este caso el área de la superficie es mayor, las células adheridas están protegidas de las fuerzas de cizallamiento y tienen más tiempo para realizar la unión inicial⁴. Para los biomateriales se deben considerar las características básicas de la superficie, como la rugosidad, la configuración física, la hidrofobicidad o incluso la composición química¹.

Existen evidencias que muestran que la adhesión microbiana depende en gran medida de las propiedades hidrofóbicas-hidrofílicas de las superficies con las que interactúan las bacterias¹⁷. En la actualidad es comúnmente aceptado que las membranas con superficies lisas, hidrófilas y eléctricamente neutras son menos propensas a la bioincrustación que las superficies rugosas, hidrófobas y cargadas¹⁸.

Es por ello, que los fabricantes de membranas aplican recubrimientos de materiales hidrófilos a la superficie de las membranas para reducir la incrustación biológica. La membrana de poliamida de la OI tiene un ángulo de contacto de 55 ± 1.8 a pH neutro¹³ y está recubierta para aumentar la hidrofilicidad de la superficie, sin embargo, Hassan et al. observaron que menos del 50% de la superficie de una nueva membrana estaba cubierta por esta capa hidrofílica¹¹.

Los apéndices físicos de algunas bacterias (flagelos, fimbrias y pili) pueden estimular la adhesión irreversible a una superficie⁵. Otras bacterias sin dichos apéndices expresan adhesinas en la pared celular que desempeñan un papel en la colonización del huésped-microbio¹⁵.

Biopolímeros como adhesivos

Algunas bacterias grampositivas y gramnegativas pueden producir biopolímeros, en forma de cápsulas y capas mucosas, que forman el glucocáliz. La cápsula es una capa de polisacáridos bien definida adherida a las células, mientras que la mucosa es una capa desorganizada de polisacáridos ubicada fuera de las células bacterianas. La presencia de estas dos estructuras no es exclusiva¹⁹.

Los biofilms están compuestos principalmente por células microbianas y SPE. Después de la primera unión, se produce un fortalecimiento de los enlaces que a menudo implica la formación de puentes poliméricos entre el organismo y la superficie. Estos polímeros “pegajosos” forman la red de la matriz y proporcionan estabilidad mecánica al biofilm⁹. Los SPE representan el 50-90% del carbono orgánico total de los biofilms⁶. Los científicos han descubierto que los SPE de los biofilms están compuestos por exopolisacáridos, glicoproteínas, glicolípidos y e-DNA (ADN ambiental)⁷.

Se han propuesto siete categorías de SPE: estructural, de sorción, tensioactivo, activo, informativo, redox-activo y SPE nutritivo⁷.

• Los SPE estructurales son polisacáridos neutros que actúan como un componente arquitectónico en la matriz, facilitan la retención de agua y nutrientes y brindan protección.
• Los SPE de sorción son polímeros cargados que se unen a otras moléculas cargadas involucradas en las interacciones entre la superficie y la célula.
• Los SPE tensioactivos son moléculas con un comportamiento anfifílico que tienen diferentes estructuras químicas y propiedades superficiales. Estas moléculas están involucradas en la formación de biofilms y algunas de ellas tienen propiedades antibacterianas o antifúngicas.
• El grupo SPE activo incluye proteínas y enzimas extracelulares necesarias para la formación y arquitectura de los biofilms.

Los adhesivos son sustancias que actúan como puentes entre las superficies y ayudan a que se peguen. Para una unión adhesiva fuerte, es necesario el establecimiento de un contacto molecular íntimo. Un adhesivo ideal tendrá un ángulo de contacto de cero o casi cero, baja viscosidad y podrá extenderse sobre la superficie y ayudar al desplazamiento del aire atrapado y de otras partículas que puedan estar presentes¹⁴. Las secreciones adhesivas se producen en organismos vivos acuáticos y terrestres con diferentes funciones. La gran diversidad de estos biopolímeros adhesivos así como su gran complejidad hacen que su caracterización sea una tarea difícil y, a menudo, se necesita una combinación de técnicas químicas y moleculares clásicas¹².

Conclusión

La formación de biofilms microbianos en los equipos de procesamiento de leche es un fenómeno inevitable que continúa desafiando a los fabricantes y plantea problemas de calidad y seguridad. Durante décadas se han realizado investigaciones exhaustivas sobre biofilms en condiciones específicas, sin embargo, a menudo las conclusiones no se pueden generalizar debido a la heterogeneidad de los diferentes entornos. Por esta razón, las estrategias de control dependen de la naturaleza de los microorganismos en un ambiente en particular y la peculiaridad de las superficies que contienen los biofilms.

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